Nguyên lý, quy trình thực hiện, lựa chọn môi trường nuôi cấy và ứng dụng trong kiểm nghiệm thuốc vô trùng
1. Giới thiệu
Trong ngành công nghiệp dược phẩm, đảm bảo tính vô trùng là một yêu cầu chất lượng đặc biệt quan trọng đối với các sản phẩm được thiết kế để sử dụng trong điều kiện vô trùng, bao gồm thuốc tiêm, dịch truyền, thuốc nhỏ mắt và một số chế phẩm sinh học.
Sự hiện diện của vi sinh vật sống trong các sản phẩm này có thể gây nhiễm khuẩn, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người sử dụng và dẫn đến việc không đáp ứng các yêu cầu chất lượng của dược điển.
Thử nghiệm vô trùng (Sterility Testing) là phép thử vi sinh nhằm phát hiện sự hiện diện của vi sinh vật có khả năng phát triển trong điều kiện thử nghiệm quy định.
Hai phương pháp truyền thống được công nhận trong dược điển gồm:
Membrane Filtration Method: Phương pháp lọc màng.
Direct Inoculation Method: Phương pháp cấy trực tiếp vào môi trường nuôi cấy.
Trong đó, phương pháp lọc màng thường được ưu tiên khi đặc tính sản phẩm cho phép, đặc biệt đối với các chế phẩm dạng lỏng có thể lọc được.
Phương pháp này giúp tách vi sinh vật khỏi phần lớn thành phần sản phẩm, đồng thời cho phép rửa màng để giảm tác động ức chế của các chất có hoạt tính kháng khuẩn.
2. Các tiêu chuẩn và quy định áp dụng
USP <71>, Ph. Eur. 2.6.1 và phương pháp tương ứng của Dược điển Nhật Bản đã được hài hòa ở những nội dung nhất định thông qua Pharmacopeial Discussion Group (PDG).
Cần phân biệt rằng ISO 11737-2 chủ yếu phục vụ việc xác lập và thẩm định quy trình tiệt khuẩn cho sản phẩm chăm sóc sức khỏe, đặc biệt là thiết bị y tế. Tiêu chuẩn này không thay thế USP <71> hoặc Ph. Eur. 2.6.1 khi kiểm nghiệm vô trùng thường quy để xuất xưởng thuốc.
3. Nguyên lý phương pháp lọc màng (Membrane Filtration)
Phương pháp lọc màng dựa trên nguyên lý giữ lại các vi sinh vật có trong mẫu thử trên bề mặt màng lọc vô trùng.
Mẫu được đưa qua màng lọc có kích thước lỗ danh định không lớn hơn 0,45 µm, với hiệu quả giữ vi sinh vật đã được chứng minh.
Sau quá trình lọc, màng được rửa bằng dung dịch phù hợp khi cần thiết để loại bỏ hoặc giảm các chất có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật.
Màng lọc sau đó được chuyển vào môi trường nuôi cấy hoặc được tiếp xúc với môi trường trong hệ thống thử nghiệm kín thích hợp.
Hai môi trường được sử dụng phổ biến gồm:
Fluid Thioglycollate Medium (FTM).
Soybean-Casein Digest Medium (SCDM), còn được gọi là Tryptic Soy Broth (TSB).
Các môi trường được ủ trong điều kiện quy định nhằm phát hiện sự phát triển của vi sinh vật có trong mẫu.
Ưu điểm của phương pháp lọc màng
Phù hợp với nhiều chế phẩm dạng lỏng có thể lọc.
Cho phép kiểm tra lượng mẫu tương đối lớn.
Hỗ trợ loại bỏ các thành phần có hoạt tính kháng khuẩn thông qua bước rửa màng.
Có thể sử dụng hệ thống lọc kín nhằm hạn chế nguy cơ nhiễm bẩn từ môi trường.
Phù hợp với nhiều chương trình kiểm nghiệm vô trùng theo dược điển.
Tuy nhiên, khả năng áp dụng phải được xác nhận đối với từng sản phẩm và phương pháp thử.
4. Môi trường nuôi cấy trong thử nghiệm vô trùng
4.1. Fluid Thioglycollate Medium (FTM)
Fluid Thioglycollate Medium là môi trường nuôi cấy được sử dụng trong thử nghiệm vô trùng nhằm hỗ trợ phát hiện nhiều loại vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn kỵ khí.
Thành phần môi trường có các chất khử giúp tạo điều kiện oxy hóa–khử phù hợp cho sự phát triển của vi sinh vật.
Một số công thức FTM chứa resazurin làm chất chỉ thị tình trạng oxy hóa của môi trường.
Điều kiện ủ thông thường:
Nhiệt độ: 30–35°C.
Thời gian: không ít hơn 14 ngày.
Môi trường FTM phải đáp ứng yêu cầu về độ vô trùng và khả năng thúc đẩy tăng trưởng vi sinh vật trước khi sử dụng theo quy định.
4.2. Soybean-Casein Digest Medium (SCDM/TSB)
Soybean-Casein Digest Medium là môi trường giàu dinh dưỡng, hỗ trợ sự phát triển của nhiều vi khuẩn hiếu khí, nấm men và nấm mốc.
Môi trường thường được sử dụng song song với FTM để mở rộng khả năng phát hiện vi sinh vật trong thử nghiệm vô trùng.
Điều kiện ủ thông thường:
Nhiệt độ: 20–25°C.
Thời gian: không ít hơn 14 ngày.
4.3. So sánh hai môi trường
Việc sử dụng cả hai môi trường giúp mở rộng phạm vi phát hiện vi sinh vật trong điều kiện thử nghiệm.
5. Dung dịch pha loãng và rửa màng trong thử nghiệm vô trùng
Bên cạnh môi trường nuôi cấy, dung dịch pha loãng và rửa màng đóng vai trò quan trọng trong quá trình xử lý mẫu.
5.1. Fluid A
Fluid A là một trong các dung dịch được sử dụng trong phương pháp lọc màng theo dược điển.
Các ứng dụng có thể bao gồm:
Làm ướt màng lọc trước khi lọc mẫu.
Pha loãng một số chế phẩm trước khi lọc.
Rửa màng nhằm giảm lượng sản phẩm còn lưu giữ.
Fluid A thường được sử dụng đối với các chế phẩm dạng nước khi phù hợp với phương pháp đã được xác nhận.
5.2. Fluid D
Fluid D là dung dịch được sử dụng trong một số ứng dụng lọc màng, đặc biệt khi cần hỗ trợ xử lý các sản phẩm có đặc tính khó thấm ướt hoặc chứa thành phần dầu, tùy theo công thức và phương pháp dược điển áp dụng.
Việc lựa chọn Fluid D phải dựa trên tính tương thích với sản phẩm, màng lọc và phương pháp thử.
5.3. Fluid K
Fluid K được sử dụng trong một số quy trình xử lý mẫu đặc thù, có thể liên quan đến chế phẩm chứa dầu hoặc các dạng bào chế khó phân tán.
Không nên xem Fluid A, Fluid D và Fluid K là các dung dịch có thể thay thế trực tiếp cho nhau.
5.4. Lựa chọn dung dịch theo ứng dụng
Không có một dung dịch rửa màng duy nhất phù hợp với tất cả các chế phẩm dược phẩm.
6. Quy trình thử nghiệm vô trùng bằng phương pháp lọc màng
Quy trình tổng quát bao gồm các bước sau:
Bước 1 – Chuẩn bị môi trường và thiết bị
Chuẩn bị:
Hệ thống lọc màng vô trùng, dạng kín hoặc cấu hình phù hợp.
Màng lọc vô trùng có kích thước lỗ danh định không lớn hơn 0,45 µm.
Môi trường FTM và SCDM.
Dung dịch pha loãng hoặc rửa màng.
Thiết bị ủ vi sinh.
Dụng cụ lấy và chuyển mẫu vô trùng.
Thử nghiệm phải được thực hiện trong môi trường vô trùng được kiểm soát, với các biện pháp phòng ngừa nhiễm bẩn thích hợp.
Bước 2 – Lấy mẫu sản phẩm
Lấy số lượng đơn vị và lượng mẫu thử theo yêu cầu của chuyên luận, USP <71> hoặc Ph. Eur. 2.6.1.
Số lượng mẫu phụ thuộc vào loại sản phẩm, quy mô lô và thể tích hoặc khối lượng trong mỗi đơn vị đóng gói.
Bước 3 – Lọc mẫu
Chuyển mẫu vào hệ thống lọc bằng kỹ thuật vô trùng.
Cho mẫu đi qua màng lọc đã được lựa chọn và xác nhận phù hợp.
Các vi sinh vật có trong mẫu, nếu được giữ lại hiệu quả, sẽ tập trung trên màng lọc.
Bước 4 – Rửa màng
Khi cần thiết, sử dụng dung dịch rửa phù hợp để giảm hoặc loại bỏ thành phần có khả năng ức chế vi sinh vật.
Số lần rửa và thể tích rửa phải được xác định dựa trên yêu cầu dược điển và kết quả thử nghiệm tính phù hợp phương pháp.
Không tự ý tăng thể tích hoặc số lần rửa vì có thể ảnh hưởng đến khả năng thu hồi vi sinh vật.
Bước 5 – Chuyển màng vào môi trường
Chuyển màng lọc vào môi trường FTM và SCDM theo cấu hình hệ thống và quy trình đã được xác nhận.
Có thể sử dụng hai màng lọc riêng biệt hoặc phương án xử lý màng phù hợp với phương pháp được chấp nhận.
Bước 6 – Ủ mẫu
Theo dõi các môi trường trong thời gian ủ để phát hiện dấu hiệu phát triển của vi sinh vật.
Bước 7 – Đọc và đánh giá kết quả
Quan sát sự xuất hiện của:
Độ đục môi trường.
Cặn hoặc màng sinh trưởng.
Các biểu hiện khác có thể liên quan đến sự phát triển của vi sinh vật.
Nếu không quan sát thấy sự phát triển của vi sinh vật trong điều kiện thử nghiệm và các yêu cầu về tính hợp lệ được đáp ứng, mẫu được đánh giá theo tiêu chí của phương pháp dược điển.
Nếu phát hiện dấu hiệu phát triển của vi sinh vật, cần tiến hành đánh giá, nhận diện và điều tra theo quy trình kiểm soát chất lượng.
Không được tự động kết luận kết quả không hợp lệ chỉ vì nghi ngờ nhiễm bẩn trong thao tác.
7. Kiểm soát chất lượng môi trường thử nghiệm vô trùng
7.1. Kiểm tra khả năng thúc đẩy tăng trưởng (Growth Promotion Test – GPT)
Growth Promotion Test được thực hiện để chứng minh môi trường có khả năng hỗ trợ sự phát triển của các vi sinh vật thử thách được quy định.
Các chủng vi sinh vật thường được sử dụng trong hệ thống kiểm tra theo USP <71> bao gồm:
Các chủng, lượng cấy thử thách và thời gian đánh giá phải tuân theo phiên bản dược điển áp dụng.
7.2. Kiểm tra tính phù hợp phương pháp (Method Suitability Test)
Method Suitability Test nhằm chứng minh rằng phương pháp thử có khả năng phát hiện vi sinh vật khi có sự hiện diện của sản phẩm cần kiểm nghiệm.
Điều này đặc biệt quan trọng đối với:
Thuốc kháng sinh.
Thuốc có chất bảo quản.
Các chế phẩm chứa thành phần kháng khuẩn.
Chế phẩm có độ nhớt cao.
Chế phẩm dầu hoặc khó hòa tan.
Nếu sản phẩm gây ức chế vi sinh vật, cần áp dụng biện pháp phù hợp như pha loãng, rửa màng hoặc trung hòa đã được xác nhận.
7.3. Kiểm tra độ vô trùng của môi trường
Môi trường nuôi cấy phải được kiểm soát về:
Tính vô trùng.
Khả năng thúc đẩy tăng trưởng.
Đặc tính vật lý và hóa học phù hợp.
Điều kiện bảo quản.
Hạn sử dụng.
Truy xuất nguồn gốc lô sản xuất.
8. Ứng dụng trong sản xuất dược phẩm
8.1. Thuốc tiêm (Injectable Pharmaceuticals)
Các sản phẩm như thuốc tiêm dạng dung dịch, thuốc tiêm truyền và một số chế phẩm hoàn nguyên có thể được kiểm nghiệm bằng phương pháp lọc màng nếu đặc tính sản phẩm cho phép.
8.2. Dịch truyền (Infusion Solutions)
Các chế phẩm như dung dịch Natri Clorid 0,9%, Glucose 5% và các dịch truyền khác có thể phù hợp với phương pháp lọc màng, tùy theo yêu cầu của chuyên luận và kết quả xác nhận phương pháp.
8.3. Thuốc nhỏ mắt vô trùng (Sterile Ophthalmic Products)
Các chế phẩm nhỏ mắt yêu cầu vô trùng có thể được thử nghiệm bằng phương pháp lọc màng.
Đối với sản phẩm có chất bảo quản, việc đánh giá tính phù hợp phương pháp là đặc biệt quan trọng.
8.4. Chế phẩm sinh học và sản phẩm công nghệ sinh học
Một số chế phẩm sinh học có thể được kiểm nghiệm bằng phương pháp lọc màng khi sản phẩm và quy trình phân tích cho phép.
Đối với các sản phẩm đặc biệt hoặc có thời hạn sử dụng ngắn, phương pháp thay thế có thể cần được thẩm định và chấp thuận theo yêu cầu pháp lý tương ứng.
9. Mối liên hệ giữa thử nghiệm vô trùng và GMP EU Annex 1
EU GMP Annex 1 nhấn mạnh rằng chất lượng vô trùng phải được đảm bảo thông qua toàn bộ hệ thống sản xuất và kiểm soát nhiễm bẩn.
Thử nghiệm vô trùng thành phẩm chỉ là một phần của hệ thống đảm bảo vô trùng, không thể thay thế cho:
Thẩm định quy trình tiệt khuẩn.
Thẩm định quy trình sản xuất vô trùng.
Kiểm soát môi trường phòng sạch.
Giám sát vi sinh vật.
Kiểm soát nguyên liệu và vật tư.
Đánh giá rủi ro nhiễm bẩn.
Chiến lược kiểm soát nhiễm bẩn (Contamination Control Strategy – CCS).
Việc sử dụng môi trường thử nghiệm vô trùng chất lượng cao góp phần hỗ trợ hệ thống kiểm soát chất lượng, nhưng không tự nó đảm bảo tính vô trùng của sản phẩm.
10. Giải pháp môi trường thử nghiệm vô trùng từ LABone
LABone cung cấp các giải pháp môi trường nuôi cấy, dung dịch pha loãng và vật tư phục vụ thử nghiệm vô trùng trong ngành dược phẩm.
Fluid Thioglycollate Medium (FTM)
Môi trường nuôi cấy hỗ trợ phát hiện vi khuẩn, đặc biệt là các vi khuẩn kỵ khí trong phép thử vô trùng.
Soybean-Casein Digest Medium (SCDM/TSB)
Môi trường nuôi cấy hỗ trợ phát hiện vi khuẩn hiếu khí, nấm men và nấm mốc.
Fluid A – Membrane Filtration Rinsing Solution
Dung dịch phục vụ pha loãng hoặc rửa màng trong những ứng dụng thử nghiệm vô trùng phù hợp.
Fluid D và Fluid K
Các dung dịch phục vụ xử lý và rửa màng đối với một số nhóm chế phẩm đặc thù theo phương pháp được áp dụng.
Ready-to-Use Sterility Testing Solutions
Các giải pháp môi trường và dung dịch pha sẵn giúp phòng thí nghiệm giảm thao tác chuẩn bị, chuẩn hóa quy trình và tăng khả năng truy xuất nguồn gốc.
Việc sử dụng sản phẩm pha sẵn cần đi kèm với đánh giá chất lượng, hồ sơ lô và xác nhận tính phù hợp với phương pháp thử của phòng thí nghiệm.
Xem danh mục sản phẩm:
Môi trường thử nghiệm vô trùng – LABone
11. Kết luận
Thử nghiệm vô trùng bằng phương pháp lọc màng là một kỹ thuật quan trọng trong kiểm nghiệm chất lượng các chế phẩm dược phẩm yêu cầu vô trùng.
Việc áp dụng USP <71> và Ph. Eur. 2.6.1 giúp chuẩn hóa các yêu cầu về phương pháp thử, môi trường nuôi cấy, điều kiện ủ và đánh giá kết quả.
Môi trường FTM và SCDM đóng vai trò trung tâm trong phát hiện vi sinh vật, trong khi các dung dịch như Fluid A, Fluid D và Fluid K hỗ trợ quá trình xử lý mẫu và rửa màng theo từng ứng dụng.
Lựa chọn đúng môi trường, dung dịch và hệ thống lọc, kết hợp với thử nghiệm tính phù hợp phương pháp, kiểm soát chất lượng môi trường và thực hành GMP, góp phần nâng cao độ tin cậy của kết quả thử nghiệm vô trùng.
LABone – Advancing Microbiology Solutions.
Tài liệu tham khảo
USP General Chapter <71> – Sterility Tests.
European Pharmacopoeia, Chapter 2.6.1 – Sterility.
Japanese Pharmacopoeia – Sterility Test.
EU GMP Annex 1 – Manufacture of Sterile Medicinal Products.
ISO 14644-1 – Cleanrooms and associated controlled environments.
ISO 11737-2:2019 – Sterilization of health care products — Microbiological methods — Part 2.